一、药物体外对脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的抗炎作用1试验材料
1.1试验药物和试剂
甘胆口服液；脂多糖（LPS）；新生牛血清；四甲基偶氮唑蓝MTT（某生物科技有限公司）；二甲基亚砜；DMEM/HighGlucose培养液（HyClone0；NO试剂检测试剂盒；小鼠IL-6，IL-10，TNF-α，IL-1β和PGE2ELISA试剂盒。TRIzolReagent（ambionbylifetechnologies,LOT：）；HiScript?IIQRTSuperMixforQpcr（+gDNAwiper）试剂（某生物科技有限公司），ChamQTMSYBR?qPCRMasterMix试剂（某生物科技有限公司）。
1.2主要仪器
离心机；CO2培养箱；TS倒置显微镜；75-2A型微量振荡器；MultiskanFC酶联免疫检测仪；BiofugePrimoR离心机；反转录PCR仪（AppliedBiosystems）；NanoDrop0spectrophtometer(ThermoScientific)；实时荧光定量PCR仪（AgilentTechnologies，StratageneMxP）。
1.3试验动物
6周龄ICR小鼠，雌雄各半，购自某养殖场。试验前适应性饲养一周，在相对温度22℃-26℃、相对湿度40%-60%实验室内饲养，光照时间统一随自然变化，供给常规饲料和饮水，自由采食进水。
2试验方法
2.1小鼠腹腔巨噬细胞的培养
取6周龄ICR小鼠，每只小鼠腹腔注射6%的淀粉肉汤1mL，每天注射一次。在第三天，脱颈处死小鼠，75%酒精浸泡3min。腹腔注射5mL的无菌PBS后，轻揉腹部3~5min后，反复抽吸并冲洗腹腔2-3次，合并悬液与离心管中，rpm，8min离心后，弃去上清，用PBS洗涤2次。用完全培养液悬浮细胞，计数1×个/mL。加入到细胞板中，于CO2培养箱中培养4h后，待细胞贴壁后，换培养液洗去悬浮的杂细胞，贴壁的细胞即为分离得到的巨噬细胞。
2.2甘胆口服液最大安全浓度测定
使用培养液将灭菌后的甘胆口服液进行倍比稀释，将不同浓度的药物加入到培养后的巨噬细胞中，每孔μL，每个浓度重复4孔，设细胞对照组。37℃，5%CO2培养24h后，每孔加入30μLMTT，培养4h后，离心后弃去上清加入μLDMSO，测定nm波长的吸光度值，计算巨噬细胞的活性公式为：细胞活性=A（实验组）/A（空白对照组）×%。
2.3细胞上清NO含量的测定
按“2.1”中培养小鼠腹腔巨噬细胞，接种于12孔板中，将不同浓度的甘胆口服液与巨噬细胞进行共培养，培养1h后，再加入LPS（终浓度5ug/mL）与巨噬细胞共培养24h，并设立空白对照组和LPS对照组，每组重复4孔。于CO2培养箱中培养24h后，收集细胞上清液，并按试剂盒说明书检测各组NO的含量。
2.4细胞上清炎性细胞因子和PGE2的测定
按“2.3”处理细胞，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞上清中IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β细胞因子和前列腺素(PGE2)的含量。
2.5实时荧光定量PCR法测定炎症相关基因mRNA相对表达量
巨噬细胞总RNA的提取：按“2.3”处理细胞，收集上清液后，PBS洗涤两次后，每孔加入1mLTRIzol裂解细胞，吹打后静置5min（4℃），转移到2mLRNase-Free离心管中。将上一步收集的上清液体离心后（rpm，5min）得到的沉淀细胞也加入到EP管中。再向离心管中加入0.2mL氯仿,上下混匀，振荡1min，于4℃静置5min。rpm，15min（4℃）离心，此时样品分为三层。小心吸取上层（透明层）液体uL转移到新的1.5mLRNase-Free离心管中。加入等量异丙醇，上下颠倒轻轻混匀，于4℃静置2h。rpm，15min（4℃）离心，弃上清，加入1mL75%酒精清洗，吹打，混匀，rpm，5min（4℃）离心后，倒去酒精，超净台风干残留酒精（30min）。加入20μLRNase-FreeddH2O，混匀溶解。置于-80℃保存。反转录前，测RNA的浓度以及A/A的比值，比值在1.8-2.0之间提示RNA纯度较高。
反转录：按照试剂说明书进行反转录。使用反转录PCR仪42℃，2min,去除基因组DNA。再将4uL5HiScript?IIQRTSuperMix加入到体系中，吹打均匀。使用反转录PCR仪50℃，15min，85℃，5sec，进行逆转录反应。
荧光定量PCR：相关细胞因子的引物序列如表3-2所示。将上一步逆转录得到的cDNA，稀释5倍后，取1μL加入到qPCR管中，加入10μL的2*ChamQTMSYBR?qPCRMasterMix，0.4μL上游引物和0.4μL下游引物，以及8.2μLRNase-FreeddH2O，使总体系为20μL。按照说明书使用realtimePCR进行qPCR反应。
以β-action为内参基因，用2-△△Ct法对各基因的表达进行相对定量。在进行2-△△Ct相对定量试验时，试验体系包括试验组和参照组、目的基因和内参基因。△Ct（目的基因）=Ct（目的基因）－Ct（同一样本的内参基因）；ΔΔCt（目的基因）=试验组△Ct（目的基因）－参照组△Ct（目的基因）均值，相对倍数（试验组/参照组）=2-△△Ct（目的基因），即2-△△Ct表示的是试验组目的基因的表达相对于参照组的相对倍数。
使用荧光定量PCR法检测IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β和iNOs的mRNA相对表达量。引物设计如表5所示。
3.试验结果
3.1甘胆口服液最大安全浓度测定
甘胆口服液最大安全浓度测定结果，如图1-1所示，甘胆口服液浓度在0ug/ml及以下时，各组细胞活性与空白组无显著性差异（P＞0.05），说明在这些浓度范围内，甘胆口服液对小鼠腹腔巨噬细胞的活性没有显著影响，为便于试验在同一水平下进行，之后体外药理实验均选用0ug/ml、ug/ml及ug/ml。
图1-1甘胆口服液对巨噬细胞活性的影响
Fig.1-1CytotoxicityofGanDanoralliquidonmacrophage
3.2甘胆口服液对细胞上清中NO含量的影响
甘胆口服液对细胞上清中NO含量的影响，如图1-2所示，经过LPS诱导后，细胞上清中NO的含量显著升高（P＜0.），说明LPS能促进巨噬细胞分泌促炎性物质NO，经过甘胆口服液处理后，细胞上清中NO的与LPS组相比显著降低（P＜0.），该结果表明甘胆口服液能显著抑制LPS诱导的促炎性细胞因子NO的分泌。
图1-2甘胆口服液对LPS诱导的炎性巨噬细胞分泌NO的影响
Fig.1-2EffectsofGanDanoralliquidontheNOofinflammatorymacrophagesinducedbyLPS.
（注：与空白组相比：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.。与LPS组相比
p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.）
3.3甘胆口服液对炎性巨噬细胞因子分泌的影响
如图1-3所示，与空白组相比，LPS显著提高了巨噬细胞分泌促炎型细胞因子IL-1β、IL-6及PEG2（P＜0.01），说明LPS成功诱导了炎性巨噬细胞。与LPS组相比，各种浓度甘胆口服液都不同程度的抑制了促炎型细胞因子的产生。由于炎症的自限性，LPS组细胞上清中抗炎型细胞因子IL-10的含量比空白组也有所增加，但与LPS组相比，甘胆口服液处理后，细胞上清中IL-10的含量与LPS组无显著性差异（P＞0.05），结果表明甘胆口服液对IL-10的分泌无明显影响。
图1-3不同药物对LPS诱导的炎性巨噬细胞分泌细胞因子的影响
Fig.1-3EffectsofGanDanoralliquidonthecytokinesecretionofinflammatorymacrophagesinducedbyLPS.
（注：与空白组相比：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.。与LPS组相比p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.）
3.4甘胆口服液对炎性巨噬细胞相关细胞因子mRNA表达量的影响
如图1-4所示，经过LPS诱导后，与空白组相比，各种促炎性细胞因子IL-6、iNOs、IL-1β及TNF-α的mRNA表达水平均显著升高（P＜0.），经过甘胆口服液处理后，能显著降低上述促炎性细胞因子mRNA的表达量，说明甘胆口服液可以通过抑制促炎性细胞因子mRNA的表达水平而发挥抗炎功效。与LPS组相比，甘胆口服液不能提高抗炎性细胞因子IL-10的mRNA水平，结果与Elisa相对应，说明甘胆口服液对炎性巨噬细胞IL-10的分泌无明显影响。
图1-4.甘胆口服液对各种促炎性细胞因子mRNA表达水平的影响
Fig.1-4EffectsofGanDanoralliquidonthemRNAexpressionofinflammatorycytokine.
（注：图A-E分别为IL-6、iNOs、IL-10、IL-1、TNF-α的mRNA相对表达量，与空白组相比：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.。与LPS组相比p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.）
二、药物体内对脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症小鼠的保护作用1.试验材料
1.1试验药物和试剂
甘胆口服液；脂多糖（LPS）；NO试剂检测试剂盒；小鼠IL-6，IL-10，TNF-α，IL-1β和PGE2ELISA试剂盒；NADH氧化酶检测试剂盒；谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒；TRIzolReagent（ambionbylifetechnologies，LOT：）；HiScript?IIQRTSuperMixforQpcr（+gDNAwiper）试剂（某生物科技有限公司），ChamQTMSYBR?qPCRMasterMix试剂（某生物科技有限公司）。
1.2试验动物
ICR小鼠60只，雌雄各半，体重20-22g。购自某养殖场。试验前适应性饲养一周，在相对温度22℃-26℃、相对湿度40%-60%实验室内饲养，光照时间统一随自然变化，供给常规饲料和饮水，自由采食进水。
1.3主要仪器
离心机；CO2培养箱；TS倒置显微镜；75-2A型微量振荡器；MultiskanFC酶联免疫检测仪；BiofugePrimoR离心机；反转录PCR仪（AppliedBiosystems）；NanoDrop0spectrophtometer(ThermoScientific)；实时荧光定量PCR仪（AgilentTechnologies，StratageneMxP）。
2.试验方法
2.1试验分组及给药
将ICR小鼠随机分为6组，每组10只。分组如表6所示。分别为正常空白对照组、模型组、甘胆口服液高剂量组、甘胆口服液中剂量组、甘胆口服液低剂量组和药物对照组。所有组的小鼠每天固定时间灌胃，药物连续灌胃15天后提前禁食12h，采用腹腔注射的方法对给药组和模型组的小鼠注射30mg/kg剂量的LPS，空白组注射等量的生理盐水。注射LPS完成观察5h，首先观察小鼠的存活情况，然后分别对每组的小鼠进行眼球取血，4°Crpm离心5min，收集血清。取出小鼠肝脏、脾脏，置于4°C生理盐水中洗去残血，滤纸吸干，液氮速冻后置于-80°C冷冻备用。
2.2血清中炎性细胞因子和PGE2的测定
按照ELISA试剂盒说明书检测各组小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β细胞因子和前列腺素(PGE2)的含量。
2.3肝脏、脾脏中NADH氧化酶（NOX）活性检测
按照试剂盒说明书检测肝组织和脾组织样品中NADH氧化酶（NADHoxidase，NOX）的含量。
2.4肝脏中还原性谷胱甘肽（GSH）的含量检测
按照试剂盒说明书检测肝组织中的谷胱甘肽（GSH）的含量。
2.5实时荧光定量PCR法测定肝脏中炎症相关基因mRNA的表达
按照上述“一，2.5”的方法测定肝脏中的IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β和iNOs的mRNA相对表达量。
3.试验结果
3.1各组小鼠整体状态观察
如图2-1所示，在LPS腹腔注射6h后，Control组各小鼠背毛光滑，精神活跃，反应灵敏，粪便成型，干湿适中。造模组小鼠精神沉郁，背毛凌乱，活动量减少，均有不同程度的腹泻现象，肛门周围污浊，并出现弓背腹痛现象。与造模组相比，地塞米松组的小鼠的体重减少及弓背腹痛现象得到明显改善，但小鼠的腹泻情况没有得到明显改善，甘胆口服液各浓度组的临床表现均有不同程度的好转，其中，甘胆口服液高浓度组小鼠的精神状态及粪便情况明显好于造模组，腹泻及弓背状况得到明显改善。小鼠处死后解剖发现，LPS组小鼠均有不同程度的肠臌气，甘胆口服液各浓度组治疗肠臌气现象明显好转，其中，甘胆口服液高浓度组没有发现肠臌气情况。
图2-1LPS造模后各组小鼠的便血腹泻症状
Fig.3-1Symptomsofhematocheziaanddiarrheainmiceofeachgroupaftermodelestablishment.
3.2空肠组织形态结构观察
如图2-2所示，正常状态下，小鼠肠绒毛结构完整，排列有序，无充血或出血现象（Control组），LPS造模组中，小鼠肠绒毛结构遭到严重破坏，内部血管结构暴露或破坏，出现明显的出血现象，黏膜基层也出现水肿现象，同时伴有免疫细胞浸润及隐窝结构破坏。地塞米松组及各浓度的甘胆口服液均可以保护LPS对肠道结构的破坏，其中，高浓度的甘胆口服液不仅保护了空肠结构，还明显改善了LPS腹腔注射后造成的空肠组织黏膜下层水肿，结果表明甘胆口服液能够改善LPS造成的急性肠炎。
图2-2甘胆口服液对LPS诱导肠炎小鼠空肠形态影响
Fig.2-2EffectofformulationonsmallintestinemorphologyofLPS-inducedenteritisinrats
注：所有图均为x镜下观察结果
Note：Allgraphsareobservedunder×magnification
3.3LPS致炎小鼠血清中炎性细胞因子及PGE2含量的测定
如图2-3所示，与空白组相比，LPS造模组小鼠血清中各种促炎性细胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α均有显著提高（P＜0.），表明经过LPS腹腔注射后，成功诱导了小鼠的急性炎症状态。与LPS组相比，用DEX及甘胆口服液低、中、高三个浓度组处理后，对三种促炎性细胞因子均有一定程度的抑制作用，其中，甘胆口服液高浓度对血清中炎性细胞因子的抑制效果与DEX组相比均无显著性差异（P＞0.05）。对于抗炎型细胞因子IL-10，其在血清中的含量以LPS组最高，这可能与地塞米松及甘胆口服液防止了LPS诱导的急性炎症的发生，使小鼠体内没有到达IL-10大量分泌的炎性状态有关。
图2-3甘胆口服液对LPS诱导的肠炎小鼠血清中炎性因子的影响
Fig.3-4.EffectofformulationoncytokinesofseruminLPSinducedenteritisrats.
(注：数据以平均数±标准差表示，n=6，与空白组相比：**P＜0.01，***P＜0.；与LPS组相比：#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.）
如图2-4所示，经过LPS诱导后，小鼠血清中PGE2的含量显著增加，说明LPS诱导的小鼠炎症能促进花生四烯酸类物质PGE2的分泌。经过地塞米松及甘胆口服液处理后，对小鼠血清中PGE2的分泌均表现出一定程度的抑制作用，结果具有显著性差异（P＜0.05）
图2-4甘胆口服液对血清PGE2含量的影响
Fig.2-4EffectofformulationonPGE2inserumfromLPSinducedenteritisrats.
(注：与空白组相比
p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.；与LPS组相比p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.)
3.4肝脏、脾脏中NOX活性检测
结果如图2-5所示，与空白组相比，LPS组NADH酶活性更高，说明LPS腹腔注射后，能够通过改变肝脏及脾脏中NAD+/NADH的比例，使线粒体膜的通透性增加，引起呼吸链中电子的过量流动，导致线粒体呼吸链复合物I和III中电子的积聚和泄漏，从而产生活性氧（ROS），过量的ROS引发氧化应激后，导致细胞损伤和凋亡。与LPS组相比，甘胆口服液的中、高浓度均能显著抑制LPS诱导的NADH酶活性升高，发挥保护肝脏、脾脏的功能。
图2-5甘胆口服液对肝脏、脾脏中NOX活性的影响
Fig.2-5EffectofformulationonactivityofNOXinliverandspleen
(注：与空白组相比p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.；与LPS组相比p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.)
3.5肝脏中还原性谷胱甘肽的含量检测
肝脏中的还原型谷胱甘肽可以通过其巯基与过氧化物、氧化自由基结合，拮抗氧化剂对细胞膜中巯基蛋白质和含巯基酶的破坏从而对抗自由基对肝脏的损害，GSH可以降低全身的炎症反应水平，具有保护重要脏器的功能。如图2-6结果所示，经过LPS造模后，LPS组肝脏中的GSH与空白组相比显著降低，经过甘胆口服液处理后，各个浓度组小鼠肝脏中的GSH含量与LPS组相比均显著升高，说明甘胆口服液可以通过提高炎症反应下的肝脏中GSH的含量发挥抗炎功能。
图2-6甘胆口服液对肝脏中谷胱甘肽还原酶含量的影响
Fig.2-6EffectofformulationonthecontentofGSHinliver
(注：与空白组相比p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.；与LPS组相比:#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.)
3.6肝脏中炎症相关基因mRNA的表达含量测定
LPS腹腔注射后，对肝脏损伤具有靶向性，因此测定肝组织中各种细胞因子mRNA的表达含量以评估甘胆口服液对LPS诱导的肝损伤的保护作用，结果如图2-7所示。经过LPS造模后，小鼠肝脏组织中的各种细胞因子mRNA水平及iNOs的含量较空白组相比均明显升高，经过药物处理后，各种促炎性细胞因子的mRNA表达水平均显著降低，其中，甘胆口服液各组的抑制水平具有浓度依赖性，说明甘胆口服液可以通过抑制肝脏组织中各种炎性细胞因子及iNOs的mRNA表达水平而发挥抗炎功能。
图2-7.甘胆口服液对各种细胞因子mRNA表达水平的影响
Fig.2-7EffectsofformulationonthemRNAexpressionofinflammatorycytokineinliver.
（注：图A-E分别为IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、iNOs的mRNA相对表达量，与空白组相比：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.。与LPS组相比:#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.）
4、
小结
试验共包括体外抗炎机理探究及体内药物有效性验证两部分。在体外，选取巨噬细胞作为靶细胞，使用MTT法测定药物的最大安全浓度，再此基础上，用LPS诱导炎症巨噬细胞，先后测定了细胞iNOs、促炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、花生四烯酸类物质PGE2及抗炎型细胞因子IL-10的基因表达水平。结果表明，甘胆口服液能从基因水平上抑制炎性巨噬细胞表达以上各类促炎型细胞因子，实验后续采用ELISA测定细胞上清中各类细胞因子及NO含量，从蛋白水平验证甘胆口服液的抗炎功效，结果与实时荧光定量PCR相一致。提示甘胆口服液可通过抑制炎性巨噬细胞分泌促炎性细胞因子发挥抗炎作用。
体内动物模型选取LPS造成的小鼠急性肠炎。在灌胃七天后，采用LPS腹腔注射，注射6小时后观察各组小鼠精神状态及粪便状态，人道处死小鼠采取空肠做后续实验。临床表征表明甘胆口服液处理后，小鼠的精神状态及粪便状态得到了明显改善，空肠黏膜层水肿程度及出血程度减轻，血清及组织中各种促炎性物质的表达在基因水平及蛋白水平上都被抑制，小鼠肝脏中NOX活性降低，脾脏中GSH升高，以上结果均提示甘胆口服液对LPS所致的急性肠炎具有良好的疗效及预防功能。
作者：南京农业大学动物医学院中兽医研究室王德云
北京生泰尔研究院侯晓礁
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